背景介绍

成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast activation protein, FAP)在多种上皮癌微环境中的肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts, CAFs)中高表达，与肿瘤细胞的生长、侵袭、转移等密切相关，而在正常成人静息的成纤维细胞及良性肿瘤间质中通常不表达。近年来研发的各种放射性FAP靶向剂在已报道的PET成像研究中显示出良好的应用前景。OncoFAP是一种亲和力较高的小分子FAP靶向剂，在几种原发和转移性实体恶性肿瘤患者中具有良好的成像效果。

提高靶向FAP的核素内照射治疗的疗效是目前的研究热点之一，其关键问题是提高放射性配体在肿瘤病灶中的滞留时间。目前已研发的放射性FAP靶向剂在病灶中的滞留时间短，限制了其治疗效果。前期研究证明配体的二聚体化是延长配体在抗原阳性结构中停留时间的一种有效方法。因此，作者制备了一种OncoFAP的二聚体衍生物——BiOncoFAP。在本研究中，作者报告了177Lu-BiOncoFAP的放射合成、其在小鼠肿瘤模型中的生物分布以及治疗结果。

设计思路

在临床前体外实验中，作者研究了OncoFAP、BiOncoFAP及几种共轭化合物的化学合成、放射性化学标记方法、产率及放化纯度，还评估了几种化合物的体外稳定性、亲和力和水溶性等。在临床前体内实验部分，作者研究了177Lu-BiOncoFAP在小鼠肿瘤模型(双侧肿瘤模型：左侧FAP阴性肿瘤、右侧FAP阳性肿瘤)中的生物分布和治疗效果，并与177Lu-OncoFAP进行对比。

数据分析

作者合成了OncoFAP及其相应的共轭化合物(OncoFAP-Fluorescein、OncoFAP-Alexa488、OncoFAP-IRDye750和OncoFAP-DOTAGA)。BiOncoFAP由OncoFAP的靶向部分和赖氨酸缩聚而成，游离的羧酸与荧光素、螯合剂DOTAGA反应得到BiOncoFAP-Fluorescein、BiOncoFAP-Alexa488、BiOncoFAP-IRDye750和BiOncoFAP-DOTAGA。使用177Lu核素对OncoFAP-DOTAGA和BiOncoFAP-DOTAGA进行放射性标记。PD-10共洗脱实验显示177Lu-OncoFAP 和177Lu-BiOncoFAP 保留了与hFAP结合的能力，且两者都具有高亲水性。上述几种化合物的化学合成方案如图1所示。

图1、OncoFAP、BiOncoFAP和相应几种共轭化合物的化学合成方案。

与OncoFAP-DOTAGA和其冷标记衍生物[natLu]Lu-OncoFAP-DOTAGA相比，BiOncoFAP-DOTAGA和[natLu]Lu-BiOncoFAP-DOTAGA显示出更强的抑制活性(图2. A, B)。随后，作者用荧光偏振分光光度法测定了OncoFAP-Fluorescein和BiOncoFAP-Fluorescein与hFAP结合的亲和力常数，两者的KD值分别为795和781 pM(图2. D, E)。此外，OncoFAP和BiOncoFAP与hFAP结合的特异性都较强。因此，二聚化没有降低BiOncoFAP与靶点结合的亲和力和特异性。接下来，作者又研究了OncoFAP和BiOncoFAP在固体载体上与hFAP的结合特性(图2. C)。竞争ELISA结果显示BiOncoFAP-Fluorescein的KD值低于OncoFAP-Fluorescein(图2. F)。OncoFAP和BiOncoFAP与肿瘤细胞的结合特征相似;在SK-RC-52细胞上未观察到二者的内化，而在HT-1080细胞上观察到高膜转运率(图2. G-J)。

图2、OncoFAP和BiOncoFAP的体外亲和力实验。compound 1: OncoFAP-DOTAGA; compound 2: [natLu]Lu-OncoFAP-DOTAGA; compound 4: BiOncoFAP-DOTAGA; compound 5: [natLu]Lu-BiOncoFAP-DOTAGA; compound 7: OncoFAP-Fluorescein; compound 8: BiOncoFAP-Fluorescein; compound 9: OncoFAP-Alexa488; compound 10: BiOncoFAP-Alexa488。

在37 °C的人和小鼠血清中孵育[natLu]Lu-BiOncoFAP-DOTAGA 24、48、72和120 h，所有实验条件下natLu-BiOncoFAP-DOTAGA的半衰期均超过5天，且均未检测到natLu脱标。接下来，作者在皮下接种SK-RC-52(左肩，FAP阴性)和SK-RC-52-hFAP(右肩，FAP阳性)的小鼠中观察OncoFAP-IRDye750和BiOncoFA-IRDye750的生物分布。OncoFAP-IRDye750和BiOncoFAP-IRDye750均在FAP阳性肿瘤中聚集，但BiOncoFAP-IRDye750在肿瘤部位的滞留时间更长。基于此结果，作者在皮下接种HT-1080(左肩，FAP阴性)和HT-1080-hFAP(右肩，FAP阳性)的小鼠模型中观察了177Lu-OncoFAP和177Lu-BiOncoFAP的生物分布。静脉注射后不久，两种化合物在FAP阳性肿瘤中特异性聚集。全身给药后24 h后，177Lu-OncoFAP的肿瘤摄取约4 %ID/g，177Lu-BiOncoFAP的肿瘤摄取约为20 %ID/g，177Lu-BiOncoFAP表现出更持久的肿瘤滞留(图3. C, D)，且177Lu-BiOncoFAP在正常器官中的摄取更低，肿瘤/器官比值高。图3. E, F所示为两种放射性化合物的肿瘤/器官比值，注射24 h后，177Lu-BiOncoFAP的肿瘤/肾脏比值为12:1，肿瘤/肝脏比值为34:1。

图3、177Lu-OncoFAP和177Lu-BiOncoFAP临床前生物分布实验。

最后，作者比较了177Lu-OncoFAP和177Lu-BiOncoFAP对接种HT-1080(左肩，FAP阴性)和HT-1080-hFAP(右肩，FAP阳性)小鼠体内肿瘤的治疗作用。与生理盐水组相比，两种放射性化合物在治疗剂量(250 nmol/kg)下均能有效地抑制FAP阳性肿瘤的生长，而177Lu-BiOncoFAP效果更好(图4. A)。而177Lu-OncoFAP和177Lu-BiOncoFAP对于FAP阴性肿瘤无明显治疗效果(图4. B)。

图4、177Lu-OncoFAP和177Lu-BiOncoFAP临床前治疗实验。

总结与展望

在本研究中，177Lu-BiOncoFAP与FAP结合具有稳定的高亲和力和特异性，在肿瘤病灶中的滞留时间长，并具有高肿瘤/器官比例。在给予治疗剂量后，177Lu-BiOncoFAP可有效抑制FAP阳性肿瘤的生长。本文中将小分子配体二聚体化以提高放射性配体在肿瘤中滞留时间的方法值得学习。但要注意的是，普遍认为FAP表达在肿瘤间质中，且基质和肿瘤细胞分布不均匀，而此项研究中所使用的细胞系FAP直接表达在肿瘤细胞表面，所以该肿瘤治疗效果只能作为参考，期待后续研究结果。