目前,实验室和临床最常使用的几种免疫检测方法中包括酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,简称 ELISA)和酶联免疫斑点法(Enzyme Linked I
目前,实验室和临床最常使用的几种免疫检测方法中包括酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,简称 ELISA)和酶联免疫斑点法(Enzyme Linked Immunospot Assay,简称 ELISPOT),但这两种检测方法存在一定的局限性。例如,ELISA 和 ELISPOT 一次只能检测一个抗原或抗体靶标,而且无法检测低浓度的样品,检测灵敏度也不够高。
为改善以上两种检测技术的不足之处,苏州大学药学院药剂系刘密教授团队研发了 FOLISA 和 FOLISPOT 两种基于 DNA 条形码和 DNA 互补配对放大法的免疫检测新技术,实现了信号放大和同时多靶点检测。
图 | 刘密(来源:刘密)
该团队介绍,FOLISA 和 FOLISPOT 不仅能够同时检测多个抗原或抗体靶标,而且检测灵敏度远高于传统的 ELISA 和 ELISPOT,FOLISA 可以到达 fg 级别,检测到 ELISA 法无法检测到的信号,而 FOLISPOT 可以检测到 ELISPOT 法无法检测的仅分泌少量抗原的细胞。
近日,相关论文以《一种用于免疫吸附测定和免疫斑点测定的多目标同时检测方法》(A Multiple-Target Simultaneous Detection Method for Immunosorbent Assay and Immunospot Assay)为题,作为当期封面文章发表在 Analytical Chemistry 上,刘密担任通讯作者,苏州大学药学院药剂系 2021 届硕士生马建婷为共同一作[1]。
据了解,ELISA 和 ELISPOT 一次只能检测一个靶标的主要原因是,这两种技术使用的是酶和底物信号放大法,一旦底物被酶催化显色后,同一个检测孔就无法再进行后续检测了。
而此次提出的免疫测定技术 FOLISA 和 FOLISPOT,在检测血清样本时能够进行多轮检测,每一轮可检测多个抗原。具体来说,FOLPISPOT 可以多轮检测分泌几种不同细胞因子的细胞,以分析各类型细胞同时分泌不同细胞因子的情况;FOLISPOT 可以用来检测仅分泌很少量细胞因子的细胞,如分泌 TGF-β 等细胞因子的细胞,且检测灵敏度远高于 ELISPOT。
研究人员表示,FOLISA 和 FOLISPOT 是通过 DNA 条形码和 DNA 互补配对法,检测抗体上连有特定 DNA 序列的 DNA 条形码,DNA 放大链和 DNA 检测链可以依次实现 DNA 互补配对以放大带检测靶标的信号。而且,这两种技术的检测灵敏度通过优化还可以进一步提高。
据悉,这两项技术中的信号放大系统是通过将 DNA 多联体与 DNA 偶联检测抗体连接来实现的,其中 DNA 多联体的长度与检测灵敏度有直接影响。通过调节反应参数能够改变 DNA 多联体的长度,从而控制整个检测系统的灵敏度。
值得一提的是,除了检测灵敏度,FOLISA 和 FOLIPSOT 的检测特异性和选择性也非常高。此外,通过研究人员的精巧设计,被检测后的信号可以在被依次洗脱后对同一样品进行多轮检测,这使得其在每轮检测中的检测靶标数量获得二次提升。
(来源:Analytical Chemistry)
研究中,由于 FOLISA 在测量单个靶蛋白方面表现出高灵敏度,该团队对这项技术展开了进一步的深入分析。他们使用具有单级信号放大系统的 FOLISPOT 检测了四种不同类型的靶蛋白,使?具有双级信号放大系统的 FOLISPOT 检测了六种不同类型的靶蛋白。
结果表明,与单级信号放大系统的 FOLISPOT 相比,具有双级信号放大系统的 FOLISPOT 检测灵敏度更高,可用于分析比强活化细胞分泌更少抗原的弱活化细胞。
此外,为验证 FOLISA 在实际应用中是否会受到血清中各种成分的干扰,该团队测量了血清中细胞因?的浓度,然后得出,使用 FOLISA 多途径同时检测人血清中六种细胞因子,与传统 ELISA 方法单独检测这六种细胞因子的效果没有显著差异。
图 | 使用 FOLISA 进行样品分析示意图(来源:Analytical Chemistry)
总体而言,无论是对于实验室样本检测还是潜在的临床样本检测来说,FOLISA 和 FOLSPOT 都为其快速、高灵敏度和多重检测的抗原或抗体提供了有效和通用的平台。而且,与现有技术 ELISA 和 ELISPOT 相比,这两项新技术不仅更灵敏、更高效,而且更节省人力和成本。
刘密表示,“我们相信,这种快速高效、多靶标、高灵敏度、高特异性的免疫检测技术,优于传统的 ELISA 和 ELISPOT 免疫测定技术,并有望在今后的实验室科研研究及临床免疫检测领域发挥重要作用。”
据了解,刘密主要专注于预防性和治疗性癌症疫苗、mRNA 疫苗递送技术和免疫多靶点检测技术等方面的研究,并拥有预防和治疗性癌症疫苗、mRNA 疫苗递送技术、免疫多靶点检测技术等国际专利和国内发明专利二十多项。
他是苏黎世瑞士联邦理工学院药学院药剂系的博士,还曾在哈佛大学医学院免疫系从事博士后研究。2018 年 12 月份加入苏州大学后,至今一直在该校药学院药剂系任特聘教授和博士生导师。